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微流控技术在生物医学上的应用

添加时间:2021-04-06 10:13:29   浏览次数:354  

  微流控芯片技术(Microfluidics)是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上, 自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力,已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。

  本文首先介绍了微流控技术原理及微流控芯片的工作原理,其次详细的阐述了微流控芯片技术,末尾介绍了微流控技术在生物医学上的应用,具体的跟随小编一起来了解一下。

  微流控技术原理

  微流控(microfluidics )是一种精确控制和操控微尺度流体,以在微纳米尺度空间中对流体进行操控为主要特征的科学技术,具有将生物、化学等实验室的基本功能诸如样品制备、反应、分离和检测等缩微到一个几平方厘米芯片上的能力,其基本特征和优势是多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成。是一个涉及了工程学、物理学、化学、微加工和生物工程等领域的交叉学科。

  微流控是系统的科学技术,它使用几十到几百微米尺度的管道,处理或操控很少量的(10*至10~18升,1立方毫米至1立方微米) 流体。开始的微流控技术被用于分析。微流控为分析提供了许多有用的功能: 使用非常少的样本和试剂做出高精度和高敏感度的分离和检测,费用低,分析时间短,分析设备的印记小。微流控既利用了它明显的特征一一尺寸小,也利用了不太明显的微通道流体的特点,比如层流。它本质上提供了在空间和时间上集中控制分子的能力。

  微流控芯片的工作原理

  微流控芯片采用类似半导体的微机电加工技术在芯片上构建微流路系统,将实验与分析过程转载到由彼此联系的路径和液相小室组成的芯片结构上,加载生物样品和反应液后,采用微机械泵。电水力泵和电渗流等方法驱动芯片中缓冲液的流动,形成微流路,于芯片上进行一种或连续多种的反应。激光诱导荧光、电化学和化学等多种检测系统以及与质谱等分析手段结合的很多检测手段已经被用在微流控芯片中,对样品进行快速、准确和高通量分析。微流控芯片的特点是在一个芯片上可以形成多功能集成体系和数目众多的复合体系的微全分析系统?微型反应器是芯片实验室中常用的用于生物化学反应的结构,如毛细管电泳、聚合酶链反应、酶反应和DNA 杂交反应的微型反应器等。其中电压驱动的毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE) 比较容易在微流控芯片上实现,因而成为其中发展很快的技术。它是在芯片上蚀刻毛细管通道,在电渗流的作用下样品液在通道中泳动,完成对样品的检测分析,如果在芯片上构建毛细管阵列,可在数分钟内完成对数百种样品的平行分析。 

  微流控芯片技术详解

  1、微流控芯片的基质材料

  基质材料是微流控芯片的载体,在微流控芯片发展的初期,硅材料作为构建微流控芯片的材料而被广泛使用,这主要归因于业已成熟的半导体技术。但是随着研究的不断深入和应用领域的不断拓展,它表现出了不同程度的局限性:硅材料属于半导体,不能承受高电压,此外,硅材料不透明,与光学检测技术不兼容。

  玻璃材料具有很好的电渗性质和优良的光学性质,无论是从其物理性质还是化学性质来讲,都非常适合于微流控芯片的制作,但是它的光刻和蚀刻技术工艺复杂、费时,制作成本过高,这些因素制约了玻璃微流控芯片的应用和推广。

  因此,研究者们开始把更多的注意力转向了原材料便宜、加工制作简单的高分子聚合物,目前,以聚二甲基硅氧烷(PolydiMethyl-Siloxane,PDMS)为代表的有机高分子聚合物已成为微流控芯片研究的热点,PDMS表现出了非常理想的材料特性:良好的绝缘性,能承受高电压,已广泛应用于各种毛细管电泳微芯片的制作;热稳定性高,适合加工各种生化反应芯片;具有很高的生物兼容性和气体通透性,可以用于细胞培养;同时具有优良的光学特性,可应用于多种光学检测系统;弹性模量低,适合于制作微流体控制器件,如泵膜等。此外,PDMS还可以和硅、氮化硅、氧化硅、玻璃等许多材料形成很好的密封。此外,较常用的高分子聚合物还包括聚甲基丙烯酸甲酯(PolyMethylMethAcrylate,PMMA)、聚碳酸酯(PolyCarbonate,PC)等。 

  2、微流控芯片的加工技术

  微细加工技术是微流控芯片发展的前提条件,微流控芯片的制作技术首先起源于制造半导体及集成电路芯片所广泛采用的光刻(Lithography)和蚀刻技术(Etching),目前已经广泛地用于硅片、玻璃和石英等基质材料上微流体网络的制作。其微制造工艺为:首先通过光学制板照相技术制备包括微流控芯片图案的掩模,制备好的掩模通常是镀有铬层的石英玻璃板;然后用甩胶机均匀地在芯片表面涂敷一层光刻胶,在紫外光下进行曝光,显影。上述工作完成之后,用相应的腐蚀剂对芯片进行蚀刻,蚀刻完成后,去除剩余的光刻胶便可获得所需的芯片微细结构。该方法工艺周期长、制作成本高,但其微加工技术非常成熟。

  与硅片、玻璃材料不同的是,可用于微流控芯片加工制作的高分子聚合物种类繁多,而且各材料之间的物理化学性质差别很大,所以它们的微加工技术表现出了一定的多样性,目前主要有模塑法、热压法、LIGA技术、激光烧蚀技术和软光刻法等。

  a、模塑法(InjecTIon Molding)

  是指通过光刻掩模技术制得凸起的微流控芯片阳模,然后在阳模上浇注液态的高分子聚合物,当高分子聚合物完全固化后将其与阳模剥离即可得到具有微流体网络的基片,适宜采用模塑法的高分子材料应该具有很低的黏度和很低的固化温度,如PDMS,环氧树脂,聚四氟乙烯等材料。

  b、热压法

  也是一种需要阳模的微流控芯片制造技术,该技术主要利用了高分子聚合物的玻璃转化温度。与模塑法相比,热压法制得的微通道重复性较差,而且管道易产生变形,操作条件相对苛刻。该方法主要应用于热塑性材料的加工,如PMMA和PC等。

  c、激光烧蚀(Laser AblaTIon)

  是一种新型的微细加工技术,它是通过紫外激光降解高分子聚合物,适宜激光烧蚀加工的材料有PMMA、聚苯乙烯、硝化纤维等。

  3、微流控芯片的微流体控制技术

  微流体操纵技术是微流控芯片技术中重要的一个研究领域之一,通过各种机械或非机械力实现对流体的驱动和控制。依据微流体驱动体系中有无机械活动部件,可以将其分为机械和非机械驱动系统。

  a、机械驱动系统

  主要包括压电微泵、静电微泵等,它主要是通过静电、压电等不同方法来触发引起的机械部件的运动,从而为微流体提供动力源,这种泵的优点是任何流体都可以推动,但其所驱动的流体呈脉冲状而不是连续式的。

  b、非机械驱动系统

  主要包括电渗泵、热毛细管泵等,其中电渗泵是微流控芯片系统中常用的一种驱动力,相对于微机械压力驱动的泵来说,电渗泵有很多优点:如电渗泵易于制作而且没有任何移动部件,电渗泵的样品柱只有少量的扩散,此外,可以采用改变微通道壁x(电势)的方法来进一步控制电渗流的量和方向。

  4、微流控芯片检测技术

  微流控芯片的结构特征决定了其检测技术的特殊性,与传统检测仪器相比,微流控芯片对其检测系统提出了更高的要求,如要求灵敏度高、响应速度快、具有平行分析功能和便携式特征等,目前基于不同原理的很多检测技术都已经应用到微流控芯片的研究中,主要有光学检测、电化学检测、质谱等方法。

  a、光学检测

  光学检测是微流控芯片检测方法中应用较广的一种,其优点在于灵敏度高、实用性强,且检测器与分析对象不需直接接触。其中激光诱导荧光检测(Laser Induced Fluorescence,LIF)是目前灵敏的检测方法之一,其灵敏度达到10-9mol/L~10-12mol/L,对于某些荧光效率高的分子,其检测能力可以达到单分子水平,因此它也是当前商品化微流控系统中被采用的检测器。但该检测设备价格昂贵,而且体积庞大,与微尺寸的微流控芯片极不匹配,一定程度上限制了其广泛推广与应用。

  b、电化学检测

  基于电化学检测原理的检测系统可以说是完整的、集成、理想的芯片检测系统之一,这主要有两方面的原因:一方面,微电极的制造技术与当前微流控芯片的加工工艺是完全兼容的,可以实现大批量生产;另一方面,电化学检测具有灵敏度高、选择性好、不受光程和样品浑浊度影响等优点,且只需要极少的外围辅助设备即可实现快速检测,图1给出的是一种便携式电化学检测系统。无疑,基于电化学原理的芯片检测技术代表未来芯片检测器的一个重要发展方向,显示了巨大的应用价值和潜力。

  c、质谱检测

  质谱检测技术作为生物化学分析的重要手段,由于能够提供试样组分中生物大分子的基本结构和定量信息,所以在微流控芯片检测器中表现出了巨大潜力,但当前质谱检测的瓶颈在于质谱仪与微流控芯片的接口问题。
 

微流控技术在生物医学上的应用

  从微流控芯片的分析性能看,其未来的应用领域将十分广泛,并且其应用领域仍在不断地拓展之中,但目前的重点显然是在生物医学领域。除此之外,高通量药物合成与筛选、环境监测、食品卫生、刑事科学及国防等方面也会成为重要的应用领域。现仅就微流控芯片在生物医学领域的应用举三个例子说明微流控芯片系统的巨大潜力:

  1、毛细管电泳分离

  毛细管电泳芯片是微流控芯片中发展早、也是发展快的一项芯片技术,目前已经成为微流控芯片领域中令人瞩目的一个分支。与传统的毛细管电泳相比,它具有自动化程度高、样品消耗少、分析速度快以及高通量等特征,在对DNA片段、多肽、蛋白质等生物大分子的分析中,它表现出了超强的分离分析能力,它被认为是后基因时代中有希望攻克蛋白质研究、基因临床诊断等科学难题的分离分析手段之一。

  1992年Manz A发表了一篇有关毛细管电泳芯片的论文,该文以荧光染料为分析对象,以电渗流作为流体驱动力,在芯片微流体网络中成功地实现了流体控制,向人们展示了毛细管电泳芯片的雏形和其优越的分离分析能力,这一研究成果引起了学术界的广泛关注和兴趣,相继各种用于氨基酸、蛋白质、药物等分离的芯片也不断开发成功。为了进一步提高芯片的分析能力,Mathies领导的研究小组在直径为200mm的圆盘玻璃芯片上集成384个毛细管电泳微通道,其有效分离长度达到了8cm,对100bp(base pair,碱基对)~1000bp的基因标准标记物达到了优于10bp的分辨率,并在该芯片上完成了1163D变异基因的PCR-RFLP(限制性片断长度多态性)分析,为临床诊断提供了依据。

  毛细管电泳微芯片是微流控分析芯片中产业化程度高、也是先实现商品化的一类芯片,早在1999年,美国惠普(现为安捷伦)与Caliper Tech-nologies公司联合研制的首台微流控芯片商品“2100生化分析仪”就已经开始投放市场,该系统使用CAliper公司生产的玻璃芯片,采用LIF进行检测,并配了5~6种试剂盒配合使用,可对DNA、RNA片段及蛋白质等进行电泳分离检测,玻璃芯片尺寸为1.8cm&TImes;1.8cm,有效分离长度约1.6cm,30min可同时完成12个样的分离检测。与传统的基因和蛋白质电泳相比,芯片毛细管电泳无需样品的走胶、染色、脱色工序,无需干燥和照相等烦琐耗时的步骤,同时快速测试多个试样,获得基因和蛋白质的电泳图和曲线。整个测试过程简化为快速、简易的三个步骤:装载样品、进行分析、观察数据。

  2、基因测序

  毛细管电泳的一个重要应用领域是基因测序,正是因为96根毛细管电泳阵列仪广泛地应用于人类基因组计划的测序工作之中,才使举世瞩目的人类基因组计划的进程大大加快,使之由原定的2003年提前到2000年基本完成。事实上,从基因测序的原理来讲,芯片毛细管电泳测序和普通毛细管电泳测序是完全一致的,但前者表现出了更大的优越性:首先由于芯片毛细管电泳独特的注样方式和更细的分离通道,所以它能实现DNA的快速分离;另一方面微流控芯片采用了半导体工业中成熟的微加工技术进行制造,所以一块芯片上可以集成更多的毛细管,实现高通量测序;由于它实现了产物处理和分析的集成化,减少了人为干扰,因此更进一步地降低了操作成本。

  Mathies领导的研究小组早在1995年就开始在微流控芯片上开展了DNA测序工作,他们在一块有效分离长度为3.5cm的芯片上测序了150个碱基,他们利用芯片变性毛细管电泳在10min之内就完成了对433个碱基序列的测定。该测序芯片的毛细管长度为3.5cm,横切面尺寸50μm&TImes;8μm。为了进一步提高DNA测序能力,到2001年他们在直径为150mm的圆形玻璃芯片上,刻蚀出了96个呈辐射型排布的毛细管电泳通道阵列,由于芯片采用旋转扫描LIF法进行检测,所以可实现平行测序,测序达500碱基。

  3、PCR反应

  生化反应芯片的功能就是把在普通实验室中进行的生化反应实验缩微到一块小小的芯片上来完成。目前报道的生化反应芯片主要包括聚合酶链反应(Polymerize Chain Reaction,PCR)芯片、药物合成芯片等,其中PCR芯片是生化反应芯片的典型代表。众所周知,常规PCR需要制样、扩增及检测等步骤,既费时又费力,而当用微流控芯片进行PCR扩增及相关检测时,则可大大简化操作步骤、显著提高检测效率。1993年Northrup等人以硅片和玻璃为基质材料初次报道了一种PCR芯片,并通过实验证明了PCR芯片可行性。该芯片的反应室刻蚀在硅片中,体积约为几微升,加热器也直接集成在芯片上,与传统的PCR相比,在相同扩增效率下,该芯片的热循环效率快2~ 10倍。为了进一步提高PCR芯片的热循环速度,Kopp M U等人发展了一种连续流动式的PCR芯片,流动式芯片下面有95℃、72℃、60℃三个不同的恒温区间,当样品流经它们时就会实现自动变温,在流动中完成变性、退火和延伸反应,达到PCR扩增的目的。

  另外,一旦把PCR芯片与毛细管电泳芯片二者集成起来的时候,其优势就显得更为明显。Lagally E T等人在玻璃芯片上制作了集阀门、疏水孔、PCR反应池以及毛细管电泳(Capillary Elec-trophoresis,CE)于一体的芯片系统,PCR反应池体积是280nL,PCR扩增前所需模板浓度为20拷贝/mL,反应室中平均仅为5~6个DNA模板分子,加热器和热电偶集成在芯片的背面,10min即可完成20个循环。反应完成后,PCR反应产物在电渗泵的驱动下进入毛细管电泳芯片中,进行在线CE分离分析。该芯片系统集取样、PCR扩增和CE分离于一体,节省了试剂消耗、加快了分析速度,同时也避免了实验操作中的人为污染。

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